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活体成像两种检测技术介绍

活体成像

特点

优点

缺点

生物发光检测

bioluminescence

★荧光素酶（Luciferase）对基因、细胞和活体动物进行标记；

★荧光素酶催化底物（例如荧光素钾盐）反应后，会产生化学发光。这种光是由化学反应而来，不需要激发光；

★标记方法是通过克隆技术，将荧光素酶的基因插入到预期观察的细胞染色体内，通过对克隆细胞进行筛选，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。再将细胞株转移至特定的小鼠体内形成模型。

★特异性强，无自发荧光；

★高灵敏度，在体内可检测到几百个细胞，检测的深度在3-100px；

★定量精确

 

★信号较弱，检测时间较长；★仪器精密度要求较高；

★细胞或基因需要转基因标记；

★不可用于人体，不适用于抗体、多肽等标记

荧光检测

fluorescence

★采用荧光报告基因(GFP、RFP等)或荧光染料进行标记；

★需要外接激发光源，利用报告基因、荧光蛋白质或染料产生的荧光，就可以形成体内的生物光源。

★荧光染料、蛋白标记能力强；

★信号强，成像速度快，操作简便，实验成本较低；

★未来可用于人；

★适用范围广，可以是动物、细胞、微生物，也可以是抗体、药物、纳米材料等。

★存在自发荧光，影响灵敏度；

★光容易被动物组织吸收；

★检测深度受限；

★背景光干扰，定量准确度低



★活体技术荧光检测

荧光蛋白标记

适用于标记细胞、病毒、基因等，通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsRed）等；


荧光染料标记

适用于标记抗体、多肽、小分子药物等；常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7


量子点标记（新的标记方法）

适用于标记肿瘤，主要应用在活细胞实时动态荧光观察与成像；

量子点（quantumdot)是一种能发射荧光的半导体纳米微晶体，外观恰似一极小的点状物。量子点荧光比有机荧光染料的发射光强的20倍，稳定性强100倍以上，具有荧光发光光谱较窄、量子产率高、不易漂白、激发光谱宽、颜色可调，并且光化学稳定性高，不易分解等诸多优点。




材料
l D-荧光素盐
u 荧光素钾盐（启维益成,G156410）
u 荧光素钠盐（启维益成,G156411）
l DPBS(Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline),withoutCa2+ 或Mg2+
l Syringefilter,0.2um
 

荧光素制备
1.      室温下融解D-荧光素（钾盐或钠盐）溶于DPBS(不含钙或镁)配成终浓度为15mg/ml。
2.      用5-10ml灭菌水预湿0.22um滤膜然后弃去灭菌水。
3.      通过准备好的0.22um注射器式滤膜灭菌荧光素溶液。
4.      按照不同的方法接种到实验室动物中（通常荧光素通过腹腔注射或静脉注射的方式接种到动物体内）。
比如：按10ul荧光素储存液/g体重的比例来注射（正常情况下每20g小鼠注射200ul，标准150mg/kg注射）。
5.      成像之前等待10-20分钟可达到最大荧光素酶信号稳定期。
6.      完成每个动物模型的荧光素酶动力学研究，以确定其信号达峰时间和平台期。
 
确定动力学曲线
 每个动物模型和实验设计的组织生物分布的动力学是不同的，动物模型注射完荧光素后为了确定达峰信号时间，在实验之前建议先建立每个体系的动力学曲线。
为您的动物模型的荧光素酶活性建立动力学曲线：
 
1.      通过以下推荐的每个所列方法（腹腔注射，静脉注射或皮下注射）注射荧光素。注射之前如果需要给动物镇静，注意这样可能使动力学曲线（荧光素酶达峰时间）稍稍延伸。根据给药途径不同荧光素的生物分布是不同的。
2.       对于腹腔（IP）或皮下（SQ）注射：
  a.      如果你要注射荧光素时动物依旧是清醒的，等待三分钟，然后根据您的方法选择（气体或注射麻醉）使其镇静。参看附录关于大鼠和小鼠麻醉剂/镇痛药物和剂量的使用。
  b.      把已经使用镇静剂的动物放入成像室中，在注射荧光素后大约五分钟能看到荧光成像。
3.       对于静脉注射（IV）：
  a.      立即对动物进行镇静（如果没有镇静）根据您的方法来选择（气体或注射麻醉）使其镇静。参看附录关于大鼠和小鼠麻醉剂/镇痛药物和剂量的使用。
  b.      把已经使用镇静剂的动物放入成像室中，在注射荧光素后两分钟内能看到荧光成像。
4.      为建立荧光素酶表达的动力学曲线，对于腹腔（IP）或皮下（SQ）注射方法每隔5-10分钟拍摄一次成像时间可达40-60分钟（对于静脉注射（IV）方法：每1-5分钟拍摄一次可达20-30分钟）。（大部分注射麻醉剂可持续20-30分钟，对于完整动力学曲线研究将需要额外的剂量！）
5.      对于您的动物模型从动力学曲线中选择最佳的成像时间点。大部分动物模型对于腹腔注射或皮下注射荧光素注入动物体内后大约10-20分钟达到信号峰值，对于静脉注射荧光素没注入后2-5分钟达到峰值。